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三、實驗室檢測操作流程

（一）病毒分離。

1.試劑配置

（1）細胞的生長液、維持液的配制見下表：

（2）糞便標本和肛拭子的處理液

完全PBS液中加入P．S溶液，終濃度為青霉素100單位/ml，鏈霉素為100μg/ ml。

完全PBS液的配置：取以下1份B液和1份C液加到8份A液中即為完全PBS工作液。

A液：

用600～800ml蒸餾水溶解以上鹽類，加蒸餾水補至1000ml，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌，即為不完全PBS工作液（不含鈣、鎂離子）。

B液：

溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。

C液：  

溶解于100ml蒸餾水中，10psi（70Kpa）15分鐘高壓滅菌。

2．病毒分離細胞系

許多細胞系可支持人腸道病毒（如EV71、CVA16）生長。

對于檢測手足口病的病原來說，建議所有懷疑含EV71、CVA16等腸道病毒感染的標本均需接種到以下兩種細胞系：

Ø       RD細胞，來源于人橫紋肌肉瘤細胞。

Ø       HEp-2細胞，來源于人喉癌上皮細胞。

3．標本的處理

（1）糞便標本和肛拭子的處理

操作步驟：

1）在離心管上標記標本號；

2）每管中加入10ml PBS、1g玻璃珠、1ml氯仿；

3）在生物安全柜中將每一份糞便標本取大約2g加入標記好的離心管中（確保離心管上的標號與原始標本的標號一致）；肛拭子為2ml；

4）剩余的原始標本最好留在原容器中，凍存于－20℃；

5）確保擰緊離心管，用機械震蕩器劇烈震蕩20min；

6）在確保離心機的蓋子蓋好和離心桶密封的情況下，用冷凍離心機在1500g條件下離心20min；

7）在生物安全柜中將每1份標本的上清液分別吸入2個有外螺旋蓋的凍存管中（如果上清液不清澈，應再用氯仿處理1次）；

8） 1管糞便懸液凍存于－20℃作為備份，另1管存于4-8℃以備接種。

（2）皰疹液標本的處理

皰疹液標本通常直接用于RNA提取或病毒分離。

（3）腦脊液標本的處理

腦脊液標本通常直接用于病毒分離。

（4）咽拭子標本的處理

咽拭子要在標本運輸（保存）液中充分攪動（至少40下），以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞等，用于病毒分離時，需要凍融一次（防止多次凍融），使細胞破裂，釋放病毒顆粒。然后在4℃條件下，10000 rpm離心20min，用上清接種到細胞上或直接提取RNA。如果發(fā)現(xiàn)有細菌污染，須用濾器過濾除菌。

4．接種和觀察（病毒分離）

（1）通常使用８ml的斜面試管培養(yǎng)細胞，傳細胞時，每管加細胞培養(yǎng)液1.5ml。顯微鏡下觀察單層細胞，以確保細胞是健康、無污染的。一個健康的單層細胞會在傳代后48小時左右形成；

（2）倒掉生長液（GM），換上1-1.2ml的維持液（MM）；

（3）每一份標本需要同時接種2支RD細胞和2支HEp-2細胞，正確標記每支細胞培養(yǎng)管（包括標本的編號、日期、傳代數(shù)）；

（4）每一種細胞至少標記一管作為陰性對照；

（5）每支試管接種0.2ml的標本懸液，培養(yǎng)溫度要求36℃。

（或者使用吸附的方法接種病毒：接種標本前，倒掉生長液（GM），每支試管接種0.2ml的標本懸液，培養(yǎng)溫度為36℃；吸附1小時后，換上1.5ml的維持液（MM）。同樣每份標本需同時接種2支RD細胞和2支HEp-2細胞。

（6）使用倒置顯微鏡每天觀察細胞培養(yǎng)管，以觀察有特征性的腸道病毒致細胞病變效應（CPE）的出現(xiàn)（如細胞變圓，折光增強并脫離管壁等）；

（7）記錄接種管和對照管細胞所發(fā)生的變化至少一周，記錄CPE（1+—4+）、提示細胞受毒性反應、老化或污染的影響而發(fā)生的變化（1+，<25%; 2+, 25%-50%; 3+, 50%-75%; 4+, 75%-100%）；

（8）如果有特征性的腸道病毒CPE出現(xiàn)，要如實記錄，并觀察直到75%的細胞發(fā)生變化（3+ CPE），然后儲藏在－20℃以備二次傳代；

（9）第一代培養(yǎng)見可疑細胞病變時應繼續(xù)傳代，待細胞病變穩(wěn)定出現(xiàn)后－20℃或－70℃凍存；

（10）一代陽性分離物再傳二代，如果又有明顯的CPE出現(xiàn)，將病毒保存在－20℃冰箱（二代病毒）。因二代病毒滴度高于一代病毒，所以選用二代病毒進行鑒定；

（11）如果7d之后沒有CPE出現(xiàn)，那么盲傳1代繼續(xù)觀察7d。（注意：同一病例標本的細胞培養(yǎng)物不能混在一起再傳代，例如：不同細胞的培養(yǎng)物應單獨傳代）；

（12）盲傳兩代后，仍然沒有出現(xiàn)CPE的，則判定為陰性；

（13）注意：如果接種后24h內出現(xiàn)CPE，很可能是標本中的非特異性成分導致的毒性反應。取100μl陽性分離物傳二代，繼續(xù)觀察；或者在接種標本吸咐1h后用維持液清洗細胞層，可能會降低毒性反應；

（14）幾個概念：

A：毒性反應：如果在接種后1-2d內細胞快速凋亡，這可能是由于標本中含有毒性物質而導致的非特異性毒性反應。這些已接種標本的試管應在-20℃凍存，融化后取0.2ml接種到同一類型細胞中（此時是第二代）。如果又出現(xiàn)了毒性反應，那么應該取原始標本用PBS稀釋10倍，再次接種到同種細胞中。這時應被認為是第一代。

 B：微生物污染：由于細菌污染而造成培養(yǎng)液混濁或細胞死亡經常使病毒造成的CPE無法確定或根本無法出現(xiàn)。重新取原始標本，用氯仿或抗生素處理，按上述步驟重新接種到新鮮細胞上。

C：盲傳：有時一周之后傳代細胞會老化，甚至細胞對照也出現(xiàn)了病變。這時已接種標本的試管應在-20℃凍存，融化后取0.2ml接種到同一類型的新鮮單層細胞中，再觀察7-10d。如果盲傳兩代后仍然沒有產生CPE，那么認為這個標本是陰性的。

5．病毒分離結果解釋

RD細胞支持HFMD的主要病原體——CVA16和EV71等多種腸道病毒的復制，CVA16和EV71均能在RD細胞培養(yǎng)中引起特殊的腸道病毒致細胞病變效應（CPE），表現(xiàn)為細胞圓縮、分散、胞漿內顆粒增加，最后細胞自管壁脫落。但相同滴度的CVA16和EV71在RD細胞中生長的速度不同，EV71的生長速度要快于CVA16，表現(xiàn)為EV71感染RD細胞后出現(xiàn)CPE的時間比CVA16早，EV71接種細胞后出現(xiàn)CPE很快，但CVA16一般要經過2次以上傳代才出現(xiàn)明顯的CPE。

若在使用RD細胞分離的同時再增加HEp-2細胞，可提高腸道病毒的分離率（分離出其他可能致HFMD的病原體，如一些柯薩奇B組病毒）。但CVA16和EV71在HEp-2細胞中均不繁殖。

（二）測定人雙份血清標本的中和抗體滴度。

比較患者急性期血清與恢復期血清中和抗體滴度，可作為腸道病毒感染的血清學診斷方法，最常用的是中和實驗，即用微量板法測定抗體滴度，是目前人腸道病毒抗體檢測的最常用方法，該方法精確且具有型特異性。

作為腸道病毒感染的診斷方法之一，可以測定血清中腸道病毒中和抗體的滴度，通常用急性期血清與恢復期血清滴度進行比較，抗體滴度4倍或4倍以上增高證明病毒感染。但是，腸道病毒隱性感染也很常見，所以在評估檢測結果時就要小心一些。在中和實驗中，一般要用人腸道病毒參考毒株（即原型株，EV71原型株為BrCr株，CVA16原型株為G-10株）或流行株，有時同時（或單獨）使用臨床分離株會有助于得到更準確的檢測結果。

使用對腸道病毒敏感的細胞，如RD細胞。用病毒（血清）稀釋液（下面液體配制中的C液，可用維持液代替）稀釋血清和制備病毒懸液，因為是用病毒來確定血清中抗體的滴度，所以要使用參考病毒（原型株），但有時使用所分離到的毒株（臨床分離株）有助于得到更準確的檢測結果，但分離株的滴度（100 CCID₅₀/0.05ml）要事先測定。

中和實驗的檢測原理：病毒感染敏感靶細胞后，引起細胞形態(tài)學變化，出現(xiàn)CPE，特異性中和抗體與病毒結合后，可使病毒顆粒失去感染性，抑制CPE的出現(xiàn)。

1．液體配制

A液：血清處理液：（100ml中含下列試劑成份）

         MEM                          85ml

         3% L-谷氨酰胺                 1ml

         7.5%碳酸氫鈉                  2ml

         胎牛血清                         2ml

         青、鏈霉素（各10000U/ml）      10ml

    B液：細胞營養(yǎng)液：（按生長液配方配制，100ml中含下列試劑成份）

        MEM                          85ml

         3% L-谷氨酰胺                1ml

         7.5%碳酸氫鈉                 2ml

         HEPES                          1ml

         胎牛血清                      10ml

         青、鏈霉素（各10000U/ml）     1ml

    C液：病毒（血清）稀釋液：（按維持液配方配制，100ml中含下列液體）

         MEM                           93ml

         3% L-谷氨酰胺                 1ml

         7.5%碳酸氫鈉                  2ml

         HEPES                            1ml

         胎牛血清                        2ml

         青、鏈霉素（各10000U/ml）        1ml

2．攻擊病毒CCID₅₀滴定和滴度梯度制備

（1）將增殖后的病毒懸液凍融3次，然后在4℃、12000rpm條件下離心10min，取上清液分裝于10支凍存管中，每管1.5ml，一般每管應在一次試驗中用完，有剩余應高壓后廢棄；

（2）加Eagle液10倍系列稀釋為10^-1至10^-8病毒液，各加入細胞板內，每孔50μl，每稀釋度4孔細胞；

（3）每孔加細胞懸液50μl，同時設細胞對照（50μl稀釋液+50μl細胞懸液）， 36℃培養(yǎng)7d，觀察細胞病變；

（4）按Behrens-Kärber公式計算出分離病毒株的CCID₅₀；

log CCID₅₀ = L-d (S-0.5)，其中：

L = 實驗中使用的最低稀釋度的對數(shù)值；

d = 稀釋梯度的對數(shù)值；

S = 終判時陽性部分的總和（即出現(xiàn)CPE的細胞孔所占的比例之和）。

（5）正式試驗前應先滴定攻擊病毒2-3次，取其平均值，求出每0.05ml中含100 CCID₅₀的病毒載量；

（6）按照計算好的稀釋比例配制攻擊病毒，求出試驗所需的病毒總量（即100 CCID₅₀/0.05ml）；

（7）取3支小試管，每只加病毒稀釋液（液體配制中的C液）0.9ml；

（8）用帶濾芯的吸尖（ART吸尖）吸0.1ml已經稀釋好的攻擊病毒液（即100CCID₅₀/0.05ml）到第一支小試管中，換另一支ART吸尖，輕輕并徹底地混勻，避免產生大量氣溶膠，按照此方法依次稀釋至1 CCID₅₀/0.05ml和0.1 CCID₅₀/0.05ml。

3．稀釋血清

（1）發(fā)病1-3d內采取患者急性期血清，發(fā)病后2-4周采取恢復期血清，分別凍存在-20℃備檢。

（2）取無菌小試管若干支（每份血清使用一支）置試管架上，每管加血清處理液（上面液體配制中的A液）0.3ml，加待測血清0.1ml，蓋緊塞子，震搖混勻，放4℃冰箱過夜，即為1：4稀釋血清。次日56℃、30min滅活。

（3）打開獨立無菌包裝48孔組織培養(yǎng)板，縱向使用，每孔加血清稀釋液（上面液體配制中的C液）0.3ml，每份血清使用一排，每排4孔。使用移液器吸取處理過的血清0.1ml加入第一孔（即為1：16），吹吸8-10次，吸0.1ml加入第二孔（即為1：64），依次至1：1024，血清稀釋的過程中不必更換吸尖。即每份血清標本進行4倍倍比稀釋，即1：4、1：16、1：64、1：256、1：1024。

（4）每份血清標本的每個稀釋度都要平行做兩孔。

4．病毒中和抗體測定的操作步驟：

（1）取一塊96孔板橫向使用，每塊板可以做8份（4對）待測血清，版面設計如下圖所示。A1-A2孔（B1-B2、C1-C2、D1-D2、E1-E2、F1-F2、G1-G2、H1-H2）中每孔加入1:1024稀釋度的待測血清0.05ml，不必更換吸尖，在A3-A4孔（B3-B4、C3-C4、D3-D4、E3-E4、F3-F4、G3-G4、H3-H4）中每孔加入1:256稀釋度的待測血清0.05ml，A5-A6孔（B5-B6、C5-C6、D5-D6、E5-E6、F5-F6、G5-G6、H5-H6）中每孔加入1:64稀釋度的待測血清0.05ml，A7-A8孔（B7-B8、C7-C8、D7-D8、E7-E8、F7-F8、G17-G8、H7-H8）中每孔加入1:16稀釋度的待測血清0.05ml，A9-A10孔（B9-B10、C9-C10、D9-D10、E9-E10、F9-F10、G9-G10、H9-H10）中每孔加入1:4稀釋度的待測血清0.05ml，A11-A12孔（B11-B12、C11-C12、D11-D12、E11-E12、F11-F12、G11-G12、H11-H12）為每份待測血清對照孔，每孔中補加稀釋液0.05ml；

（2）上述孔中分別加入病毒0.05ml（病毒滴度事先已經稀釋為100 CCID₅₀/0.05ml）；

（3）蓋好蓋子后用微量板混勻器混勻，放入36℃ CO₂孵箱中孵育2h；

（4）另取一塊96孔板縱向使用，做100 CCID₅₀/0.05ml病毒滴度的核實（每次實驗都必須做）。每孔先加病毒稀釋液（試劑配制中的C液）0.05ml，然后從0.1 CCID₅₀/0.05ml加起，每孔0.05ml，每個稀釋度8孔，不必更換吸尖，一直加至100 CCID₅₀/0.05ml；同時留出4孔做為細胞對照孔，每孔加入0.1ml病毒稀釋液，然后放入4℃冰箱中暫存；

（5）在孵育期間，用消化液消化細胞，準備細胞懸液，細胞懸液的濃度為2×10⁵個/ml，每塊96孔板至少需要準備10ml；

（6）孵育結束后每個待測血清孔、血清對照孔（待檢標本板）和病毒回滴孔和細胞對照孔（病毒回滴板）分別加入0.1ml細胞懸液，然后用微量板混勻器混勻，放入36℃ CO₂孵箱中孵育培養(yǎng)；

（7）使用倒置顯微鏡每天觀察CPE，并記錄病毒滴定結果，以不產生細胞病變的血清最高稀釋度的倒數(shù)為終點效價。當100 CCID₅₀/0.05ml的病毒對照孔出現(xiàn)完全病變時，判定最終結果（約5~7d）；

（8）注意：如果病毒對照結果（病毒回滴）不在32~320 CCID₅₀/0.05ml的范圍內，實驗無效，就要重復實驗。

5．結果判定

當最高稀釋度血清的2孔中有1孔出現(xiàn)細胞病變，另一孔不出現(xiàn)細胞病變，該稀釋度的倒數(shù)計即為該血清標本的中和抗體效價；當高稀釋度2孔完全病變，相鄰低稀釋度2孔完全不病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標本的中和抗體效價；當兩個相鄰稀釋度血清均出現(xiàn)1孔細胞病變，另1孔不出現(xiàn)細胞病變，則兩者平均稀釋度的倒數(shù)即為該血清標本的中和抗體效價。

對于HFMD的雙份血清中和實驗結果來說，如果恢復期血清較急性期血清EV71或CVA16中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高即可確診；如果恢復期血清較急性期血清其它腸道病毒中和抗體滴度出現(xiàn)4倍或4倍以上增高可證實該腸道病毒感染，是否為病因需要其它相關實驗證實；如果單份血清中和抗體滴度大于1:256也有診斷意義，血清中和抗體滴度為1:128判定為可疑陽性。

（三）逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）。

1．RNA提取

可使用多種商業(yè)化試劑盒來提取RNA，針對臨床標本應選擇質量較高的“用于臨床標本病毒RNA提取的試劑盒”，也可使用全自動RNA提取儀進行提取。針對病毒分離物，核酸提取比較容易，大部分商業(yè)化RNA提取試劑盒都可有效的提取到RNA。RNA提取依據使用的試劑不同，嚴格按說明書進行操作。

2．逆轉錄-聚合酶鏈反應（RT-PCR）

（1）引物序列合成

國家脊灰實驗室自行設計3對引物，分別為人腸道病毒通用引物、EV71特異性引物和CVA16特異性引物。各省CDC依據引物序列在質量有保證的公司合成,引物合成后,需要做預實驗，保證引物合成沒有質量問題后,分發(fā)給地市級CDC。

1）人腸道病毒（包括EV71、CVA16）核酸檢測通用引物序列：

PE2（上游）：5`- TCC GGC CCC TGA ATG CGG CTA ATC C -3`

PE1（下游）：5`- ACA CGG ACA CCC AAA GTA GTC GGT CC -3`

2）EV71核酸檢測引物序列：

EV71-S（上游）：5`- GCA GCC CAA AAG AAC TTC AC -3`

EV71-A（下游）：5`- ATT TCA GCA GCT TGG AGT GC -3`

3）CVA16核酸檢測引物序列：

CVA16-S（上游）：5`-ATT GGT GCT CCC ACT ACA GC-3`

CVA16-A（下游）；5`-TCA GTG TTG GCA GCT GTA GG-3`

（2）實驗設計

1）在PCR記錄紙（實驗記錄紙）上記錄本次實驗操作者姓名，實驗日期，所鑒定標本的名稱以及標本的順序，與PCR儀排列的順序一致。

2）標記好加標本和對照的PCR管（陽性對照，陰性對照和試劑對照）。

A：陽性對照：參比RNA，省級CDC提供（只是在初次使用，常規(guī)不建議使用，以防污染）。

B：陰性對照：使用正常細胞RNA或臨床標本腸道病毒陰性的RNA（每次實驗要設立）。

C：試劑對照：用去離子水代替標本（試劑初次使用時必須做）。

（3）RT-PCR擴增反應和條件

1）從臨床標本或病毒中提取的RNA和各種RT-PCR試劑應該一直放在冰浴盒上；

2）配下列試劑主溶液：

10×PCR Buffer···································································5.0μl

dNTPs（2.5mM each）·······················································2.0μl

上游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μl

下游引物（0.1μg/μl）·························································1.0μl

RNA酶抑制劑（RNasin,40U/μl）······································0.5μl

Taq DNA聚合酶（5U/μl）·················································0.5μl

AMV逆轉錄酶（10U/μl）··················································1.0μl

模板RNA··········································································3.0μl

RNase Free dH₂O···························································36.0μl

                         50.0μl

3）在PCR儀上進行RT-PCR反應，反應步驟如下：

42℃························45min

95℃························3min

95℃························20s

45℃························25s       ×32個循環(huán)

72℃························30s

72℃························10min

 4℃························Soak

3．電泳分析

（1）將已經聚合的3%的瓊脂糖凝膠放在電泳裝置上；

（2）在帕拉膜（Parafilm）上加上6 × 電泳載樣緩沖液（每個反應需1μl）。再加上5μl的PCR反應產物與之混合；

（3）將電泳緩沖液倒在電泳裝置中，用吸尖將樣品與載樣緩沖液的混合溶液加到孔中；

（4）蓋上蓋子，接通電源，以10V/cm電壓（恒定電壓）電泳，大約35-40min，直到溴酚藍跑到凝膠的底部的時候，停止電泳；

（5）將膠取出，并注意保持凝膠的方向；

（6）在1μg/ml的溴化乙錠溶液中染色15min，

注意：溴化乙錠溶液是有毒、致畸、并且致腫瘤的物質，操作時要加小心，并戴雙層手套。如果儲存在避光的容器中，溴化乙錠溶液可以重復使用。溴化乙錠廢棄物按醫(yī)療廢棄物中化學品的有關規(guī)定處理。

（7）在蒸餾水中涮一下凝膠；

（8）在紫外透射儀下觀察PCR產物電泳結果，并照相作記錄。

有條件的實驗室可以使用全自動電泳分析儀。

4．結果解釋

使用全自動電泳分析儀的實驗室可以通過儀器自動讀取PCR產物大小，來判斷結果。通過瓊脂糖凝膠做PCR產物電泳的實驗室，需要參照DNA分子量對照對照，比較標本的PCR產物與陽性對照的PCR產物在凝膠上的位置以及大小來解釋結果。

RT-PCR實驗結果解釋表

(四) Real-time RT-PCR （rRT-PCR）

1. 病毒核酸提取

參考常規(guī)RT-PCR病毒核酸提取步驟和注意事項。

2. Real-time RT-PCR （rRT-PCR）

依據不同廠家的試劑盒，嚴格按相應說明書操作和判斷結果。有5種試劑盒，分別為One Step Real-time PCR法檢測EV71病毒核酸（單通道檢測）；One Step Real-time PCR法檢測CVA16核酸（單通道檢測）；One Step Real-time PCR法檢測腸道病毒核酸（單通道檢測）；One Step Real-time PCR法同時檢測EV71和CVA16核酸（雙通道檢測）；One Step Real-time PCR法同時檢測EV71和腸道病毒核酸（雙通道檢測）。下面舉2個例子來說明單通道檢測和雙通道檢測的操作規(guī)程和注意事項。

（1） One Step Real-time PCR法檢測EV71病毒核酸（單通道檢測）

①反應體系配置：反應體系共25μl，模板量可根據樣本情況自行決定（臨床標本通常使用5μl的RNA模板量），不夠部分以水補足。如選用另外試劑盒，反應體系及條件隨之變化。

a.從試劑盒中取出相應的試劑，反應液在室溫融化后，瞬時離心，按n+1配置反應體系（n=樣本數(shù)+1管陽性對照+1管陰性對照），每個測量反應體系配置如下表：

b.將上述反應液混勻離心后，按照每管20μL分裝于各熒光PCR儀適用的PCR管中。

c.加樣：將提取好的樣本RNA，分別加入上述分裝好的PCR反應管中，模板量可根據樣本情況自行決定（臨床標本通常使用5ul模板量），不夠部分以水補足?？偡磻w積25μL。

②熒光RT-PCR循環(huán)條件設置

③對照設置

陰性對照：核酸提取時以滅菌雙蒸水代替標本，每次實驗應設立。

陽性對照：由省級實驗室提供EV71陽性核酸（只在評價試劑時使用）

④結果分析條件設定和結果判斷

閾值設定

原則以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點，結果顯示陰性為準，或可根據儀器噪音情況進行調整。

Ct值≤35.0的樣本為陽性。

38.0> Ct值>35.0的樣本為臨界值。

Ct值≥38.0的樣本或無數(shù)值的標本為陰性。

（2） One Step Real-time PCR法同時檢測EV71和CVA16核酸（雙通道檢測）

雙通道可以同時檢測EV71和CVA16核酸,在提取核酸后短時間(2.5小時)內檢測到標本中是否含EV71或CVA16核酸。

①反應體系配置

反應體系共25μl，模板量可根據樣本情況自行決定（臨床標本通常使用5μl模板量），不夠部分以水補足。如選用另外試劑盒，反應體系及條件隨之變化。

a.先將試劑解凍，從試劑盒中取出相應的試劑，反應液在室溫融化后，瞬時離心，按n+1配置25μl反應體系（n=樣本數(shù)+1管陽性對照+1管陰性對照），每個測量反應體系配置如下表：

b.將下述反應液混勻離心后，按照每管20μL分裝于適用的PCR管中。

c.加樣：將提取好的樣本RNA，分別加入上述分裝好的PCR反應管中，模板量可根據樣本情況自行決定（臨床標本通常使用5ul模板量），不夠部分以水補足。總反應體積25μL。

②熒光RT-PCR循環(huán)條件設置

③結果分析條件設定和結果判斷

陰性對照：核酸提取時以滅菌雙蒸水代替標本。

陽性對照：提取好的陽性核酸作為模板RNA。

閾值設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點，結果顯示陰性為準，或可根據儀器噪音情況進行調整。

Ct值≤35.0的樣本為陽性。

Ct值無數(shù)值的標本和Ct值≥38.0的樣本為陰性樣本。

38.0> Ct值>35.0的樣本為臨界值。

注：熒光PCR同時讀取FAM和HEX，進行雙通道檢測，FAM熒光Ct值為CVA16的結果，HEX熒光 Ct值為EV71的結果。